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你了解现在的DNA检测技术吗?

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【概要描述】法医DNA检验技术经历了多位点DNA指纹图分析技术、扩增片段长度多态性分析技术(AMP-FLP)、线粒体DNA检测技术三大技术革命

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【概要描述】法医DNA检验技术经历了多位点DNA指纹图分析技术、扩增片段长度多态性分析技术(AMP-FLP)、线粒体DNA检测技术三大技术革命

  • 分类:行业新闻
  • 发布时间:2024-06-27 13:59
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DNA检测技术的应用,为法医学带来了一场技术革命。通过对遗传物质DNA的序列多态性及长度多态性的检验,即可实现个体识别及亲权鉴定,该技术正在成为当前法医物证鉴定最主要的技术手段。

人体细胞中含有约30亿个碱基对的DNA,每个人的DNA都不完全相同,不同的碱基对数目达几百万之多,因此通过分子生物学方法显示的DNA图谱也因人而异。法医DNA检测技术就是通过对遗传物质DNA的序列多态性及长度多态性的检验来进行法医学的个体识别及亲权鉴定。如今,该技术在侦查破案、查找被拐卖儿童和无名尸源、死亡案件个体识别以及证实犯罪等方面发挥了显著作用,已成为法医物证检验的常规技术,为打击违法犯罪提供了强有力的武器。

 
法医DNA检验的科学基础

 法医DNA检验技术的研究和分析对象主要是生物体内DNA的多态性。一般来说,基因或非编码区的DNA标记在染色体上的位置称为基因座,而位于同一个基因座上不同序列的基因被称为等位基因。DNA多态性就是指作为遗传标记的基因座存在多个等位基因,分析基因座上等位基因的差异就是实现同一认定的生物学基础。

人类基因组DNA多态性源于基因组DNA中的碱基突变,变异后的基因遗传给子代,显示出DNA分子水平上的个体差异。DNA多态性可分为两类:一类表现在特定基因座上相关序列长度上的个体差异,叫长度多态性;另一类表现在特定基因座上碱基序列的个体差异,叫序列多态性。长度多态性多存在于基因组DNA中的一类串联重复序列,其串联重复单位(核心序列)数目在人群中存在较大差异,具有高度多态性,称此重复为可变数目串联重复序列(VNTRs);根据重复单位长度,分为二类:重复单位长度为10~70bp,称为小卫星;长度为2~6bp的,称为微卫星,或叫STR。

按孟德尔遗传规律,子代DNA的特定序列来自双亲,即在同源染色体中位于同一位置上的两个等位基因,一个从母亲处继承,另一个从父亲处继承,这两个等位基因可相同也可不同。这种符合孟德尔遗传规律、具有个体特异性的DNA多态性便是进行个体识别和亲子鉴定的理论基础。

法医DNA检验的技术方法

法医DNA检验技术经历了多位点DNA指纹图分析技术、扩增片段长度多态性分析技术(AMP-FLP)、线粒体DNA检测技术三大技术革命。目前已发展到以荧光标记多基因座STR复合扩增检测技术、线粒体DNA检测技术和SNP分析技术为主导的技术体系。

(一)DNA指纹图分析技术

“DNA指纹”或DNA分型(图谱)由英国遗传学家Alec Jeffreys在1985年首次提出,是出现最早的一种法医DNA技术。DNA指纹属于限制性片段长度多态性标记(RFLPs)。利用可以识别和切断特异DNA序列的限制性内切酶,将人类DNA切割成不同长度的DNA片段,经电泳分离后,用Southern印迹将酶切片段转移到尼龙膜或硝酸纤维膜上,用带有荧光或放射性同位素标记的特异性探针进行杂交,检测出不同长度的DNA片段,即得到该限制性内切酶及特异性探针的DNA图谱。DNA指纹图技术根据所使用的探针不同可分为多位点与单位点,其主要差别是多位点探针由于同时检测多个位点,DNA指纹图谱谱带多,形成的多基因座RFLP图谱被称为DNA指纹;而单位点探针由于检测单个位点,DNA图谱只出现一条带(纯合子)或两条带(杂合子),通常将这种单基因座RFLP图谱称为DNA纹印。DNA指纹虽然可以进行同一认定和判定亲权关系,但却存在着一些局限性,如方法繁杂、周期长、实验条件高等,这些局限性的存在使得DNA指纹技术不太符合司法鉴定的要求,故没有得到更大的发展与普及。

(二)扩增片段长度多态性分析技术

1985年,美国Cetus公司的Mulis.KB等人创立了聚合酶链式反应(PCR)技术。该技术是一种快速的体外扩增特殊DNA序列片段的技术,它能在短时间内复制成百上千的目标DNA序列,获取足够量的特异性片段,以供DNA的进一步分析。该技术根据VNTR基因座侧翼序列,设计、合成与侧翼互补的寡核苷酸作为PCR引物,应用PCR技术扩增包含VNTR基因座侧翼和重复单位的序列,最后通过凝胶电泳分离不同片段长度的扩增产物,根据扩增片段长度差异确定其基因型。因此,这种用PCR技术检测VNTR基因座多态性的技术被称为扩增片段长度多态性(AMP-FLP)分析;它充分发挥了两个优势:一是基因组VNTR基因座具有高度多态性优势,二是PCR快速、高效扩增的优势。AMP-FLP分析是20世纪90年代法医DNA分析技术的一项突破性进展,使DNA分型实现了高效、快速、灵敏的目标,被称为第二代DNA分型技术。

法医学鉴定应用AMP-FLP具有以下几个特点:DNA需要量少,检测效率高,适用于陈旧、降解、腐败检材;可进行多个基因座复合扩增检测;具有种属特异性;能进行混合检材的个体识别;可获得不连续的等位基因频率;实验周期短,可靠性好,重复性高;操作相对简单。但该技术也存在着一些缺陷,如VNTR扩增片段长度相对较长,灵敏度较STR低;等位基因片段间长度相差很大,易产生较小等位基因优先扩增现象;若DNA严重降解,较大的等位基因可能扩增失败等。

三)荧光标记多基因座STR复合扩增检测技术

1988年,Saiki等人首次发现人类基因组存在一些短串联重复片段(STR),这些序列能用PCR扩增且具有高度多态性。STR位点因其PCR产物片段长度短、DNA分子组成结构简单、PCR反应中引物与模板退火温度相似等特点,为对多个STR位点复合扩增检测提供了条件。90年代中后期,随着现代化DNA检测设备DNA测序仪的问世,使应用荧光染料标记引物的方法对多个STR位点同步检测分析成为现实。这种检测技术通过同时检验多个STR位点获得足以认定个体的遗传信息,被称为荧光标记多基因座STR复合扩增检测技术。该技术首先在扩增引物上附上荧光发光基团,当带有发光基团的DNA片段经过激发光照射区时发出对应波长的荧光,该荧光光谱信息被光电检测器采集后,由电子系统及计算机进行储存并处理。通过比对样品光谱信号与标准比对品(标准比对品是一系列大小不同但长度已知的DNA片段)信号出现时间,计算出相应DNA片段的长度大小,从而得到检测结果。然后,根据荧光的光谱范围,检测结果参照所扩增位点的全等位基因混合物,就能知道所检测到的DNA片段等位基因命名,记录下来就是该样本在该位点下的DNA分型。

STR基因座具有以下适宜于法医DNA检验的特点:STR多态性基因座数量多,片段长度一般小于400bp,易于扩增,适于微量检材的检验;等位基因大小比较接近,较小等位基因优先扩增不明显;不同位点的STR基因座片段长度差异较小,便于复合扩增,提高检测效率。此外,TR基因座分析方法简便、判型准确,分型程序明确、规范,所得分型结果图形简单,便于实现DNA分型标准化和自动化,便于分型数据的计算机储存、联网检索。目前,STR技术已经是法医学中应用范围最广泛,使用频率最高的DNA分型技术。

(四)线粒体DNA检测技术

线粒体DNA(mt DNA)是人类第二套基因组DNA,其突变率较高,且多集中于D环区中的高变区域,无母系亲缘关系个体间线粒体DNA高变区碱基组成序列差异显著,集中对该高变区进行序列测定即可达到对检材的个体来源认定。它由母系遗传,已有数据表明,四代之内所有母系亲属的线粒体序列相同,因此可用于母子鉴定。

检测线粒体DNA的多态性需用测序技术,法医DNA实验室最常用的是荧光染料标记全自动测序技术:利用DNA聚合酶对样品DNA进行PCR扩增,采用标记引物或标记终止物双脱氧核苷酸的方法使扩增产物带上荧光,在全自动测序仪上检测,从而得到所测序列的碱基排列顺序。

由于人体的每个细胞中均有含有成千上万的线粒体细胞器,因此其内部的DNA拷贝数比核DNA多许多倍,在检测上具有更高的灵敏度。其闭环结构具有抵抗降解能力。因此,可以进行陈旧、腐败检材的检测;在一些角化的细胞,如毛干、指甲等含有角化的细胞,细胞核DNA大部分已降解,前述各种检测方法已无法检测,但线粒体仍然存在,线粒体DNA检测技术可以实现这类检材的人体遗传分析与亲子鉴定,这是该技术的最大优点。但在法医检验中还存在以下问题:由于其灵敏度高,增加了污染的危险性,需要严格控制污染;由于其为母系遗传,不能区分开来自同一母系的个体和进行父权鉴定;其序列分析方法复杂、繁琐,工作量大,费用昂贵、出错率高。

(五)单核苷酸多态性(SNP)分析技术

单核苷酸多态性是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性,这种变异可由单个碱基的转换或颠换所引|起,也可由碱基的插入或缺失所致,但通常所说的SP并不包括后两种情况。它是人类基因组中最常见、分布最广泛的DNA多态性类型,占所有已知多态性的90%以上。虽然SNP多态信息不如多等位基因的STR(SNP只有两个等位基因和三种基因型),但分布的高密度性弥补了这一不足。SNP是一种早期突变,较TR等多态性遗传标记具有更高的遗传稳定性。因此,SNP可用于人类起源、进化、迁移的研究,也非常适用于法医个体识别和亲权鉴定。SNP比重复序列更易进行PCR扩增,而且没有基因漏扩和影子带现象,有利于基因分型。由于SNP是二态的,易于自动化批量检测,易于计算机分析结果、确定基因频率。因此,SP尤其适用于高度腐败、降解、陈旧的法医生物检材,一些学者将其称为第三代分子标记。

SNP的检测方法很多,在众多方法中,对待检测片段进行直接扩增、测序是最为准确的方法。近年来随着技术的发展,采用了微阵列DNA芯片、飞行质谱分析和变性高效液相层析法等非电泳分型技术,大大加快了SNP检测效率。

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