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DNA片段的扩增及电泳鉴定

DNA片段的扩增及电泳鉴定

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  • 分类:行业新闻
  • 发布时间:2024-06-30 12:58
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在DNA检测的过程中,从鉴定人提供的样本中提取到的DNA往往都较难观测,为了检测时便于观察和提高实验数据的准确性,需要对DNA片段进行扩增。

PCR的实验原理

PCR利用了DNA的热变性原理以及复性原理,采用适温延伸、高温变性以及低温复性,让核酸片段实现了体外扩增,可以将微量的目标DNA片段扩增上百万倍,从而提高对DNA分子的分析和检测。PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器,通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合,一次PCR一般要经历30次循环。

因为PCR有着很高的灵敏度以及特异性,简便快速,所以这种技术已经成为目前临床基因扩增实验室接受程度最高的技术。

PCR实验步骤

1. 移液:用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书,在微量离心管中依次加入各组分。

2. 离心:待所有组分都加入后,盖严离心管的盖子,将微量离心管放入离心机里,离心约10s,使反应液集中在离心管的底部 (提高反应速率)。

3. 反应:设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。

PCR反应完成后,常用毛细管电泳对PCR的产物进行鉴定。

电泳鉴定的原理

毛细管电泳是指离子或带电粒子以毛细管为分离室,以高压直流电场为驱动力,依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异,实现分离的液相分离分析技术。

1. 电泳是指在外电场作用下,荷电粒子在缓冲溶液中的定向移动现象。荷电粒子在缓冲溶液中的定向移动现象。淌度:单位电场下离子的迁移速度。

2. 电渗:是指毛细管内溶液在外力电场的作用下整体朝一个方向运动的现象。电渗流:当在毛细管两端加电压时,双电层中的阳离子向阴极移动,由于离子是溶剂化的,所以带动了毛细管中整体溶液向阴极移动,形成电渗流。

电泳鉴定实验步骤

1.按照仪器操作手册开机,预热、输入各项参数,如毛细管温度、操作电压、检测波长和冲洗程序等。操作缓冲液需过滤和脱气。冲洗液、缓冲液等放置于样品瓶中,依次放入进样器。

2.毛细管处理的好坏,对测定结果影响很大。未涂层新毛细管要用较浓碱液在较高温度冲洗,使毛细管内壁生成硅羟基,再依次用0.1mol/L氢氧化钠溶液、水和操作缓冲液各冲洗数分钟。两次进样中间可仅用缓冲液冲洗,但若发现分离性能改变,则开始须用0.1mol/L氢氧化钠溶液冲洗,甚至要用浓氢氧化钠溶液升温冲洗。凝胶毛细管、涂层毛细管、填充毛细管的冲洗则应按照所附说明书操作。冲洗时将盛溶液的试样瓶依次置于进样器,设定顺序和时间进行。

3.操作缓冲液的种类、pH值和浓度,以及添加剂的选定对测定结果的影响也很大,应照各品种项下的规定配制,根据初试的结果调整、优化。

4.将待测供试品溶液瓶置于进样器中,设定操作参数,如进样压力(电动进样电压)、进样时间、正极端或负极端进样、操作电压或电流、检测器参数等,开始测试。根据初试的电泳谱图调整仪器参数和操作缓冲液,以获得优化结果。而后用优化条件正式测试。

5.测试完毕后用水冲洗毛细管,注意将毛细管两端浸入水中保存,如果长久不用应将毛细管用氮吹干,最后关机。

6.定量测定以采用内标法为宜。用加压或减压法进样时,供试品溶液黏度会影响进样体积,应注意保持试样溶液和对照溶液黏度一致;用电动法进样时,被测组分因电歧视现象和溶液离子强度会影响待测组分的迁移量,也要注意其影响。

 

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